蛋白樣品制備詳解—蛋白質(zhì)保護篇

  蛋白質(zhì)是成分高度復(fù)雜的，復(fù)雜的生物大分子包括1個或多個長鏈氨基酸. 蛋白或肽折疊形成二級和三級結(jié)構(gòu)， 和其他蛋白亞基相互作用來形成四級結(jié)構(gòu)。蛋白是在結(jié)構(gòu)上彼此不同的同時出于穩(wěn)定性和活性的目的要求不同的周邊環(huán)境. 蛋白當脫離他們天然的環(huán)境后是非常容易降解，變性和沉淀的。

  在蛋白抽提過程中，細胞和細胞器膜是被破壞掉從而釋放蛋白到溶液中使蛋白高度不穩(wěn)定. 蛋白是暴露在溶液中不同的PH值，離子強度，溫度和蛋白酶中. 盡管所有的蛋白是不同的他們要求不同的參數(shù)比如穩(wěn)定性，溶解性和活性, 然而一些因素如果處理好的話可以保證活性蛋白的抽提，能夠在蛋白抽提過程中保護蛋白的組分或者因素如下:

緩沖液組分: 在蛋白抽提過程中為蛋白提供適宜的緩沖液環(huán)境是非常重要的，這樣蛋白可以應(yīng)付突然變化的PH值。如果蛋白抽提裂解緩沖液不是蛋白適宜的緩沖液蛋白會很容易發(fā)生不可逆的變性。

一個好的蛋白抽提緩沖液必須在要求的PH值下有很強的緩沖能力，水溶性，化學(xué)穩(wěn)定性，和加到蛋白抽提溶液中的其他添加物的兼容性，以及蛋白下游應(yīng)用的兼容性。

大部分常規(guī)使用的生物緩沖液有 pKa 大約 7因此可以用于生理PH值下。 常用的生物緩沖液的是磷酸鹽，Tris, MOPS 和HEPES. 這些緩沖液通常使用在 20 mM濃度以上來保證足夠的緩沖能力.

抽提時的溫度: 來自于哺乳動物細胞的蛋白適合于他們活性的溫度大約 37 °C以及許多來自于生長在37°C細菌的細菌蛋白也有蛋白穩(wěn)定性的最適溫度在37°C。鑒于此，我們可以預(yù)計成功的蛋白抽提在室溫進行。然而溶液中的蛋白在室溫中會發(fā)生降解因為溶液中蛋白的環(huán)境和細胞中的環(huán)境是不同的。溶液中蛋白沒有受到如同細胞中伴侶的保護。除此之外蛋白由于存在于溶液中的內(nèi)源蛋白酶從而容易發(fā)生降解。細胞中的內(nèi)源蛋白酶在細胞中存在特定的小室中因此不能降解所有的細胞蛋白。蛋白酶的活性在 4°C 時會減弱通常來說蛋白的抽提應(yīng)該在冰上進行從而得到活性蛋白。

細胞裂解和蛋白抽提緩沖液的添加劑: 有一些可以添加到蛋白抽提緩沖液中的添加劑，一些是通用的，一些是和需要抽提的蛋白特定的.

鹽: 鹽類加入用來維持蛋白抽提溶液的離子強度. 加入的抽提緩沖液中的鹽的濃度基于蛋白生理環(huán)境下的離子強度。太高或太低濃度的鹽會導(dǎo)致蛋白的沉淀或變性。絕大多數(shù)用于維持蛋白抽提緩沖液中離子強度的常規(guī)使用的鹽包括氯化鈉，硫酸銨。

蛋白酶/肽酶: 蛋白酶和肽酶是可以在特定位點切割蛋白從而降解他們。有四種已知蛋白類別的蛋白酶包括絲氨酸蛋白酶， 半胱氨酸蛋白酶, 天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶. 當?shù)鞍锥皇堑鞍酌感枰怀樘峥梢约尤氲鞍酌敢种苿﹣硪种频鞍椎慕到?/span>。特定蛋白酶抑制劑和蛋白酶抑制劑混合物取決于科研人員的需要有商品化的產(chǎn)品。使用蛋白酶抑制劑混合物是不錯的選擇因為人們對于細胞中存在哪些內(nèi)源蛋白酶的了解是有限的。金屬蛋白酶被金屬螯合劑所抑制比如EDTA 和EGTA. 最常規(guī)使用的蛋白酶抑制劑是EDTA, PMSF, 亮肽素和 pepstatin A.

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì): 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是影響的滲透的化合物. 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可以協(xié)助蛋白的折疊。 他們是作為添加劑來增強蛋白在溶液中的可溶性和穩(wěn)定性。在蛋白抽提過程中最常使用的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)包括甘油, 去污劑比如 NP40和糖類如葡萄糖,蔗糖等.

還原劑: 還原劑可以保護蛋白免受氧化的損害. 當抽提特定性的蛋白時可以使用還原劑，這些蛋白易于發(fā)生氧化損害。還原劑包括  DTT 等.

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