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      高起始量帶分子標簽的DNA-Seq分析

      更新時間:2020-11-10 點擊次數(shù):1791
      高起始量帶分子標簽的DNA-Seq分析
      ThruPLEX® Tag-Seq HV
      · 更可靠的DNA-Seq分析:文庫中整合了離散且均衡的分子標簽(UMIs),提供更可靠的數(shù)據(jù)表現(xiàn)! 
      · 兼容更高起始量的多種樣本:5至200 ng FFPE DNA、cfDNA起始,30 μl建庫體積,無需濃縮樣本!
      · 刪繁就簡:單管三步操作流程,2 h內(nèi)完成illumina文庫構建!
      · 一致高效:無畏起始量差異,高實驗重復性、更均一的文庫覆蓋度,高GC含量區(qū)域偏差更小!
      · 更適合于稀有突變分析,減少擴增誤差及測序錯誤!
       
      ■ 產(chǎn)品說明
      目前,將NGS用于正確檢測低頻突變的關注度逐漸上升。各領域科研人員正在突破稀有突變檢測靈敏度與特異性的瓶頸,而這些問題主要是由樣品準備、擴增偏差及測序錯誤所引起的。而向illumina文庫添加*的分子標簽(Unique Molecular Identifiers, UMIs)與*的雙端index(Unique Dual Indexes, UDIs),能有效改善稀有突變檢測的準確性。出于文庫制備與測序質(zhì)量直接相關的考慮,我們特別優(yōu)化推出了接頭上帶UMIs及整合UDIs的全新產(chǎn)品——ThruPLEX Tag-Seq HV試劑盒。該產(chǎn)品保留了單管流程、操作簡便的特點,支持5至200 ng input DNA起始用于稀有變異分析!
       
      正確的樣本數(shù)據(jù)回溯、更小的手動操作誤差,科研人員再不用擔心珍貴樣本損失了!
       
      ■ 來自UMIs的“助攻”
      ThruPLEX Tag-Seq HV在莖環(huán)形接頭上引入了離散的UMIs,文庫中每個DNA分子有144種可能的標簽組合,漢明間距超過6,具有高度的差異性。我們特別設計了UMI序列,以使序列顏色分布達到平衡,在illumina平臺上能獲得更好的測序數(shù)據(jù)。我們也謹慎調(diào)整了各UMI接頭的濃度,以使144種序列組合在各種DNA起始量都能均勻展現(xiàn),減少偏差。
      由7位堿基所組成的UMIs位于reads的開始位置,能夠”Tag”到DNA模板上,用于識別一致序列,減少擴增或者測序錯誤帶來的假陽性突變。
      這種特別優(yōu)化的UMIs設計,確保了更簡便的樣本demultiplexing過程,分析更容易!
       
      ■ “抓住”游離DNA,“揪出”稀有突變
      游離DNA(cfDNA)是由細胞凋亡后所釋放,游離于體液中的DNA小片段。對cfDNA的測序分析具有較大難度,特別是涉及腫瘤學研究中的稀有突變分析時。
      Takara科學家采用ThruPLEX Tag-Seq HV對10 ng起始的Quan-Plex Patient-Like ctDNA標準品(AccuRef)構建文庫,該ctDNA(循環(huán)腫瘤DNA)標準品帶有一系列特征化的不同頻率(0%,1%,5%)突變位點。文庫構建完成后,腫瘤相關的基因采用IDT xGEN Pan Cancer Panel進行捕獲富集。結果顯示目標區(qū)域的捕獲高效可靠,10 ng起始的DNA樣本約有79%的reads來自或者接近目標區(qū)域。
       
      上表數(shù)據(jù)顯示,由坐標法或UMIs去除重復reads后的目標區(qū)域平均覆蓋度是相似的,與Picard MarkedDuplicates所報道的PCR duplication結果一致。
      隨后,Takara科學家用UMIs鑒定了ctDNA標準品中特定位點的實際突變頻率,結果顯示,檢測到的突變頻率分別與預期1%、5%的等位突變頻率接近,而陰性對照組沒有在位點處檢測到任何突變。
       
      如果采用未去重的文件或僅用坐標法去重的文件,會檢測出大量的超過0.5%等位基因頻率的不一致突變。而UMIs引入、校正后,相應突變體的數(shù)量變少了,結果的正確性進一步提升,顯示出UMIs在降低擴增及測序錯誤上的重要作用。
       
      更具代表性的是,使用未去重或者僅用坐標法去重的文件分析,在預期的EGFR L858R突變附近觀察到大量的低頻及隨機等位基因頻率突變。而用UMI校正、過濾后的一致性序列reads,清除了假陽性突變,得到了預期的突變分析結果!
       

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      品牌              Code No.                  產(chǎn)品名稱                    包裝量  

      Clontech     R400742     ThruPLEX® Tag-Seq HV     24 Rxns

      Clontech     R400743     ThruPLEX® Tag-Seq HV     96 Rxns

      Clontech     R400735     ThruPLEX® Tag-Seq HV Core Components     96Rxns

      Clontech     R400734     ThruPLEX® Tag-Seq HV Core Components     24Rxns 

      Clontech     R400739     ThruPLEX® HV UDI 1-24     24 Rxns

      Clontech     R400738     ThruPLEX® HV UDI Set A     96 Rxns

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